本期，我們繼續(xù)聊聊數(shù)字PCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用，上期內(nèi)容：
基因突變檢測(cè)與治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)
癌癥相關(guān)基因突變隨疾病進(jìn)展或治療的進(jìn)展而動(dòng)態(tài)變化，因此基因突變的檢測(cè)可以用來監(jiān)測(cè)癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。
例如，KRAS基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌和胰腺癌中均有較高的發(fā)現(xiàn)率，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)及患者預(yù)后直接相關(guān)?，F(xiàn)有的檢測(cè)KRAS突變的方法有Sanger測(cè)序、二代測(cè)序、ARMS-PCR等，Sanger測(cè)序的突變檢測(cè)限約為20%；二代測(cè)序方法的突變檢測(cè)限約為5%；ARMS-PCR方法的突變檢測(cè)限在1%左右，而dPCR用于突變檢測(cè)的突變檢測(cè)限可以達(dá)到0.05%~0.10%，甚至更高（表1）。
表1不同方法學(xué)KRAS基因突變檢測(cè)限
文獻(xiàn)案例1：
數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血漿中 KRAS突變，可作無創(chuàng)生物標(biāo)志物
KRAS 突變是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對(duì)抗表皮生長因子受體治療產(chǎn)生耐藥性的原因。通過數(shù)字PCR檢測(cè)血漿cfDNA中的 KRAS 突變（“液體活檢”）已成為一種非常靈敏且有潛力的連續(xù)活檢疾病監(jiān)測(cè)的替代方案。
在這項(xiàng)研究中，通過ddPCR分析了10名結(jié)直腸癌患者血漿DNA中的 KRAS G12V突變，并與6名健康供體進(jìn)行了比較。
結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者KRAS 突變?yōu)?5.62copies/mL（中位數(shù)），而在健康對(duì)照中僅發(fā)現(xiàn)殘留拷貝（0.62copies/mL，p =0.0066）。轉(zhuǎn)移性疾病患者的血漿KRAS G12V突變拷貝數(shù)明顯高于M0患者（中位數(shù)分別為126.25copies/mL和9.37copies/mL，p =0.0286）。
與健康對(duì)照比較，結(jié)直腸癌患者血漿中野生型KRAS和KRASG12V突變的拷貝數(shù)顯著升高。此外，在癌癥轉(zhuǎn)移的情況下，突變拷貝數(shù)會(huì)更高，說明KRASG12V突變與預(yù)后相關(guān)，如進(jìn)展差、術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高、生存期短等。因此該突變可作為監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展的無創(chuàng)生物標(biāo)志物之一，利用ddPCR檢測(cè)結(jié)直腸患者血漿中KRASG12V突變是可取的。
文獻(xiàn)案例2：
使用數(shù)字PCR檢測(cè)乳腺癌和胃癌患者的HER2擴(kuò)增
人表皮生長因子受體-2基因（HER2，ERBB2）編碼HER2蛋白，該HER2蛋白在正常組織中罕見表達(dá)灶，但是HER2異常擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致HER2蛋白在乳腺癌、胃癌和其他腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。
目前，HER2基因表達(dá)檢測(cè)被廣泛用作乳腺癌和胃癌患者靶向治療的輔助診斷工具，批準(zhǔn)用于臨床的檢測(cè)通常是基于蛋白質(zhì)水平的免疫組織化學(xué)或基因水平的熒光原位雜交，但這些檢測(cè)只能用于組織標(biāo)本，無法對(duì)腫瘤細(xì)胞的HER2進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
為了評(píng)估該測(cè)定與目前臨床使用的測(cè)試的總體一致性，招募了206患者，并對(duì)每個(gè)樣本的FFPE組織切片進(jìn)行了FISH、IHC和血液樣本數(shù)字PCR檢測(cè)。
在206例乳腺癌患者中，68例（33.01%）經(jīng)dPCR鑒定為HER2陽性。對(duì)51個(gè)IHC2+樣本進(jìn)行FISH檢測(cè)，以確認(rèn)HER2基因是否發(fā)生突變。FISH結(jié)果顯示11例（21.57%）為陽性，其余40例（78.43%）為陰性。乳腺癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為96.1%（206例中有198例），敏感性為92.65%（68例中有63例），特異性為97.83%（138例中有135例）（如下表）。
對(duì)91例胃腺癌患者進(jìn)行了dPCR和IHC/FISH檢測(cè)。結(jié)果顯示，21例（23.08%）被dPCR認(rèn)定為HER2陽性，70例（76.92%）為HER2陰性。IHC確定了19例陽性（20.88%）和60例陰性（65.93%）。其余12例IHC2+胃癌樣本的FISH檢測(cè)顯示2例陽性（17%）和10例陰性（83%）。胃癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為95.6%（87/91），敏感性為90.48%（19/21），特異性為97.14%（68/70）。
利用dPCR技術(shù)來檢測(cè)血液標(biāo)本中HER2基因表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果顯示血液標(biāo)本HER2檢測(cè)的準(zhǔn)確性與組織標(biāo)本一致性很高，說明通過dPCR檢測(cè)血液中HER2表達(dá)水平是一個(gè)非常好的手段，可作為癌癥治療過程中的監(jiān)測(cè)工具。
參考文獻(xiàn)：
[1]Ibrahem S, Seth R, O'Sullivan B, Fadhil W, Taniere P, Ilyas M. Comparative analysis of pyrosequencing and QMC-PCR in conjunction with high resolution melting for KRAS/BRAF mutation detection. Int J Exp Pathol. 2010 Dec;91(6):500-5.
[2]Linardou H,Briasoulis E,Dahabreh I J, et al. All about KRAS for clinical oncology practice; gene profile,clinical implications and laboratory recommendations for somatic mutational testing in colorectalcancer [ J].Cancer Treatment Reviews,2011,37(3):221-233.
[3]Li J,Makrigiorgos G M. A new platform for highly improved mutation detection in cancer and genetic testing [J]. Biochemical Society Transactions, 2009,37(Pt 2):427 -432.
[4]Milbury C A,Li J，MakrigiorgosG M. Ice-COLD-PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-abundance unknown DNAmutations [J]. Nucleic Acids Research,2011,39(1):1-10.
[5]Azuara D, Ginesta MM, Gausachs M, et al. Nanofluidic digital PCR for KRAS mutation detection and quantification in gastrointestinalcancer [ J]. Clinical Chemistry,2012: 58(9):1332-1341.
[6]Olmedillas López S, García-Olmo DC, García-Arranz M, Guadalajara H, Pastor C, García-Olmo D. KRAS G12V Mutation Detection by Droplet Digital PCR in Circulating Cell-Free DNA of Colorectal Cancer Patients. Int J Mol Sci. 2016 Apr 1;17(4):484.
[7]Zhu Y, Lu D, Lira ME, Xu Q, Du Y, Xiong J, Mao M, Chung HC, Zheng G. Droplet digital polymerase chain reaction detection of HER2 amplification in formalin fixed paraffin embedded breast and gastric carcinoma samples. Exp Mol Pathol. 2016 Apr;100(2):287-93.
