NGS全流程產(chǎn)品優(yōu)化
核酸提取
核酸提取是NGS實(shí)驗(yàn)流程中的起點(diǎn)，核酸提取的得率、完整性和純度直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功與否。
實(shí)驗(yàn)室需要提取各種類型樣本的核酸以備后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建等NGS流程。實(shí)體瘤患者的樣本類型有石蠟包埋組織、全血、穿刺液、胸腹水等，血液腫瘤患者樣本類型主要是全血和骨髓等，生殖遺傳的患者樣本類型主要有全血、羊水穿刺液、干血斑等，感染性患者的樣本類型主要有胸腹水、肺泡灌洗液、腦脊液、痰液和全血等。根據(jù)樣本差別，提取的方式、試劑盒也有所不同。
核酸提取基本步驟
1、裂解細(xì)胞，釋放核酸：使用裂解液破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的核酸游離在體系中；
2、核酸的分離與純化：將與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除；
3、核酸富集與洗脫：采用洗脫液處理吸附有核酸的吸附物，富集得到目的核酸。
常用核酸提取方法
1、溶液法
比較經(jīng)典的提取方法，苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來(lái)。而DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取水層，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)操作，并合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇/異丙醇來(lái)沉淀核酸，然后再進(jìn)行分離和純化、溶解后即可得到高純度核酸。
溶液法成本低，但存在有毒試劑，影響操作人員健康，而且較為繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，提取的核酸質(zhì)量也較為一般。
2、柱提法
利用特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附核酸，而蛋白質(zhì)、多糖、脂類等基本不吸附，被離心沉淀與核酸分離的原理。硅膠膜表面存在的硅醇基團(tuán)呈弱酸性，水化后帶負(fù)電。樣品裂解后，如果溶液中存在一定濃度的陽(yáng)離子時(shí)，會(huì)中和DNA硅醇基團(tuán)之間的表面負(fù)電荷，從而使DNA能夠牢固地吸附在硅膠膜表面。而當(dāng)處于低鹽水溶液時(shí)，DNA磷酸基團(tuán)和硅膠膜的硅醇基團(tuán)之間存在排斥，硅膠膜就會(huì)把DNA釋放出來(lái)，從而達(dá)到分離純化核酸的目的。
柱提法試劑盒價(jià)格較低，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，在市面上應(yīng)用較為廣泛。但是其對(duì)樣本需求量大，損失多，對(duì)于珍稀樣本無(wú)能為力，特別是在法醫(yī)、考古等領(lǐng)域顯得力不從心。同時(shí)由于需要反復(fù)離心不便于高通量、自動(dòng)化操作等。
3、磁珠法
與硅基離心柱原理類似，磁性顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸特異性結(jié)合和解離，先使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na+）與磁珠表面羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面，利用磁珠的磁性，可通過(guò)外加磁場(chǎng)進(jìn)行收集洗脫，獲得質(zhì)量較好的核酸模板。
磁珠法不需要離心、無(wú)需加入多種試劑，操作簡(jiǎn)單，符合核酸自動(dòng)化提取要求，但是成本較高。
蛋白酶K在核酸提取中的作用
蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來(lái)的強(qiáng)力蛋白溶解酶，具有很高的比活性。蛋白酶K能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，分離DNA與蛋白質(zhì)，使DNA能夠更好被提取。還可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板的RNA，在RNA的提取和檢測(cè)過(guò)程中起到不可或缺的作用。而RNA極不穩(wěn)定、易于被廣泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境、嚴(yán)格防止RNase污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。
核酸提取的下游應(yīng)用
1、PCR擴(kuò)增：從提取的DNA或RNA中擴(kuò)增目的片段，用于分子診斷、分子生物學(xué)研究、藥物研發(fā)、病毒檢測(cè)等。
2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用于定量檢測(cè)DNA或RNA的含量，可以用于基因型檢測(cè)、差異表達(dá)分析、細(xì)胞數(shù)量、病毒載量、轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)等。
3、基因測(cè)序：對(duì)提取的DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序，用于腫瘤基因組學(xué)、新生兒篩查、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和基因診斷等。
4、蛋白質(zhì)研究：從提取的DNA或RNA中合成蛋白質(zhì)，用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等。
這些下游應(yīng)用可以幫助我們更深入地研究生物樣本中的DNA或RNA，并揭示它們?cè)谏飳W(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的重要作用。
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